佰利萊生物為您講解PCR反應效率低值解析

反應效率視為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析設計和優(yōu)化的關(guān)鍵因素。利用標準曲線(xiàn)(通過(guò)對目標模板進(jìn)行連續梯度稀釋獲得) 獲取效率值。該效率值可作為總反應的“健康"標志。低效率與高效率所造成的影響有所不同。改善上述兩種情形的步驟則相差甚遠。理想的反應效率為100%，但反應效率在90–110% 范圍內都是可以接受的。

 確定某個(gè)特定的分析效率是否低下的方法是稀釋模板生成標準曲線(xiàn)(模板稀釋的范圍應涵蓋所有未知樣本)，然后查看該范圍內的效率。它應盡可能接近100%。熔解曲線(xiàn)出現多個(gè)峰或凝膠顯示多種產(chǎn)物意味著(zhù)反應源物質(zhì)之間存在競爭作用，這必將對反應效率產(chǎn)生影響。一旦確定反應被抑制或效率較低，則可采取一些步驟將效率值重新調整到理想范圍內。

1、對于抑制作用，可去除模板濃度zui高的反應孔并重新分析標準曲線(xiàn)。如果效率重新回到110% 以下，則分析良好。

2、另一種解決方案是重新純化模板。切記應延長(cháng)干燥時(shí)間，以去除乙醇沉淀過(guò)程中的乙醇，或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。

3、通過(guò)分析優(yōu)化可解決效率低下的問(wèn)題。此過(guò)程有時(shí)相對簡(jiǎn)單，但在某些情況下，隨著(zhù)分析復雜度的提高，優(yōu)化過(guò)程可能十分耗時(shí)費力。

4、擴增單個(gè)產(chǎn)物時(shí)，將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應效率，但當出現競爭作用時(shí)，則應降低鎂的濃度。

5、在某些情況下(主要是多重反應中)，必須采用引物和探針優(yōu)化基質(zhì)。此時(shí)，需檢測正向引物與反向引物的比值或濃度，有時(shí)甚至還需檢測探針比值，以找出分析的理想濃度組合。引物濃度介于100至600nM之間，而探針濃度則在100nM至400nM 之間。

6、根據引物的Tm 值，確保熱循環(huán)條件(尤其是退火溫度)適當，且引物設計時(shí)使之有相似的Tm 值。