Cassification
循環(huán)次數 :一般為25 a~ 30次。循環(huán)數決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低,可增加循環(huán)數以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數為30個(gè)左右,循環(huán)數超過(guò)30個(gè)以后,DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數的增加而增加,出現了所謂的“平臺期"。
循環(huán)參數如下:
1.預變性
模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關(guān)重要,建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū),一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。
2.變性步驟
循環(huán)中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列*變性,可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過(guò)長(cháng)損害酶活性,過(guò)短靶序列變性不*,易造成擴增失敗。
3.引物退火
退火溫度需要從多方面去決定,一般根據引物的Tm值為參考,根據擴增的長(cháng)度適當下調作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
4.引物延伸
引物延伸一般在72℃進(jìn)行(Taq酶最適溫度)。但在擴增長(cháng)度較短且退火溫度較高時(shí),本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴增片段長(cháng)短而定,一般推薦在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
5.循環(huán)數
大多數PCR含25-35循環(huán),過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴增。
6.zuì后延伸
在zuì后一個(gè)循環(huán)后,反應在72℃維持10-30分鐘.使引物延伸*,并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
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