如何利用ELISA篩選以及ELISA方法操作的注意事項有哪些呢?相信很多做實(shí)驗的小伙伴都有這樣的疑問(wèn),佰利萊生物就給大家總結一下；

ELISA ,全稱(chēng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗,主要利用的是抗原抗體特異性結合的特點(diǎn),可分為植接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法等。

下面以間接法為例進(jìn)行介紹:

一、方陣ELISA。用途:（1）融合后確定鼠血清中抗體效價(jià);（2）拿到單抗腹水后,需要建立ELISA方法時(shí)先要確定包被原及抗體的優(yōu)質(zhì)工作濃度。

經(jīng)典的方陣ELISA :將抗原和抗體各自稀釋成不同梯度濃度,結果OD值P/N> 2的均判為陽(yáng)性,選取OD值在1.0左右的那個(gè)Ag-Ab濃度為工作濃度,主要原因與酶標儀靈敏度有關(guān)。

但是.對于抗原抗體而言,由于它們被稀釋成不同濃度,那么在理論上,每個(gè)抗原稀釋度情況下 ,總有一個(gè)抗體的稀釋度其OD值在1.0左右,那么到底選取哪一個(gè)OD值1.0左右的好呢 ?這就需要同時(shí)用藥物做個(gè)抑制來(lái)看,哪個(gè)濃度下抑制情況好,就取哪個(gè)抗原抗體濃度做工作濃度。

二、間接競爭ELISA :在用方陣ELISA確定好抗原抗體最-佳結合濃度后就可以做間接競爭ELISA了,其目的主要是考察抗體的特異性、繪制標準曲線(xiàn),計算抗體對抗原的半數抑制、檢測限等參數,也可以來(lái)檢測未知樣品中的抗體。方法是用確定的抗原包被,在加一抗時(shí)同時(shí)加入不同濃度的標準品( 一般是藥物),然后加二抗,顯色。用藥物(即標準品)濃度的對數為橫坐標、抑制率為縱坐標,繪制ELISA標準曲線(xiàn),計算相關(guān)的參數,之后就可以將未知的樣品所測OD值代入曲線(xiàn)方程求其中抗體的含量。通常這是建立ELISA檢測方法的必-備項目。

標準曲線(xiàn)可以繪成直線(xiàn)或是曲線(xiàn)(二次方程或三次方程)。通常是選取線(xiàn)性比較好的幾個(gè)點(diǎn)繪成直線(xiàn)。直線(xiàn)斜率越高說(shuō)明抗體的特異性及靈敏性好, R2

值越靠近1 ,則說(shuō)明線(xiàn)性關(guān)系好。曲線(xiàn)繪好后,有一些常用的參數,如抑制率、半數抑制、檢測限、定量限、標準偏差、變異系數等等:

抑制率(%) =1- B/B0 ( B0為不含藥物的OD值; B為含有藥物的OD值)

標準差(SD) =[∑(Xi-B)2/(n- 1)] 1/2;

標準偏差( RSD) = SD/B

半數抑制:指用藥物(半抗原)去做競爭實(shí)驗時(shí)呈現50%抑制效果時(shí)的藥物濃度。藥物濃度越低,而抑制率越高,則表示抗體對藥物的特異性越好,靈敏度也高。半數抑制濃度IC50對應的OD值 : OD IC50= 0.5?B0

檢測下限(LOD)對應的OD值:ODLOD=B0-3SD;

定量限(LOQ)對應的OD值:ODLOQ=B0-10SD:

三、間接ELISA操作中具體注意的問(wèn)題:
間接ELISA-般有6個(gè)步驟:包被抗原、封閉、加一抗(在做競爭時(shí)同時(shí)加入藥物)、加二抗、顯色、終止。其中除了加顯色和終止外,其余步驟之間都要進(jìn)行洗板。在這里面,每一步都非常重要 ,假如有一步疏忽都會(huì )造成結果的不準確。